1.  Dictyostelium

Dictyostelium discoideum (D.D.) est un micro-organisme eucaryote qui présente de nombreuses similarités avec les cellules animales. L'étude chez Dictyostelium de grands sujets actuels de biologie comme la motilité cellulaire, la transduction du signal, la phagocytose et la mort cellulaire devrait fortement contribuer à la connaissance de ces fonctions chez les eucaryotes supérieurs.

Dictyostelium possède l’unique propriété de pouvoir vivre à l’état de cellules isolées ou de colonies multicellulaires. Il se multiplie à l'état unicellulaire dans des conditions nutritionnelles favorables mais dans des conditions de carence alimentaire, les cellules (Fig. 1, « Vegetative Amoebae ») s'engagent dans un cycle de différenciation et de morphogenèse. Celui-ci comporte d'abord une phase d'agrégation au cours de laquelle Dictyostelium passe de l'état unicellulaire à l'état pluricellulaire. L’agrégation est dirigée par des gradients d'AMP cyclique. L’AMPc qui joue le rôle de chimio-attracteur, provient d’un groupe ou d’une cellule centrale, il est détecté par les récepteurs membranaires des autres cellules et relayé de proche en proche conduisant à la formation de jolies ondes spirales (Fig. 1, « Aggregation »). L'agrégat de quelques 100,000 à 1,000,000 de cellules (Fig. 1, « Mound ») est ensuite le siège d'une différenciation des cellules. Puis il s’allonge pour former une sorte de doigt qui rampe sur le support tel un ver de terre (Fig. 1, « Slug ») vers une zone favorable où il se transformera en pseudo-champignon (Fig. 1, « Fruiting-Body »), qui pourra lui même si les conditions redeviennent meilleures redonner à nouveau des cellules isolées.

Figure 1: Cycle de vie du Dictyostelium depuis le début le début du sevrage des amibes jusqu’à la formation du pseudo-champignon (fruiting body). La taille de l’image des amibes correspond environ à 100 mm alors que les autres ont une taille de 1 mm environ (figure issue de la page web de F. Siegert :  http://www.zi.biologie.uni-muenchen.de/zoologie/dicty/dicty.html).

Le ver de Dictyostelium est constitué de deux principaux types de cellules issues de sa différentiation : un quart de cellules prestalk à l’avant du ver qui formeront ensuite les pieds et l’enveloppe du champignon et le reste étant essentiellement des cellules prespore qui pourront se retransformer en amibes si les conditions redeviennent meilleures. Il a été observé expérimentalement que la vitesse du ver est proportionnelle à sa longueur (et non à sa largeur)  (Inouye et Takeuchi, 1979), et que la force motrice totale du ver est proportionnelle à son volume (Inouye, 1984).  Ceci a amené les auteurs de ces expériences à proposer un modèle de la migration postulant (i) que l’ensemble des cellules participent également au mouvement avec la même force, (ii) que la force motrice totale du ver s’équilibre avec une grande force de résistance indépendante de la taille à l’avant du ver. Ainsi, la vitesse du ver augmente avec sa taille (voir discussion du manuscrit en préparation ci-joint après). Néanmoins, l’origine de cette force de résistance reste assez mystérieuse. De plus ce modèle très simple n’explique pas certaines observations.

Par exemple, une portion purement prestalk coupée du reste du ver avance sensiblement plus vite qu’une portion purement prespore (Inouye et Takeuchi, 1979). L’étude de la distribution spatiale de la myosine II a montré que cette protéine contractile est localisée essentiellement sur la périphérie du ver, et spécialement à l’avant (Eliott et col., 1991). Ceci semble indiquer qu’il existe une certaine hétérogénéité de la distribution des forces le long du ver : les cellules prestalk tireraient le reste du ver.

Par ailleurs, il est maintenant bien établi que le mouvement du ver de  Dictyostelium est dirigé par des gradients d'AMP cyclique comme dans la phase d’agrégation (chimioattraction). Dans la région antérieure du ver, les cellules ont un mouvement circulaire autour de l’axe du ver, alors que dans la région postérieure, les cellules ont un mouvement rectiligne périodique (Siegert et Weijer, 1992). Des ondes spirales d'AMPc prenant naissance dans la région antérieure prestalk semblent donc se propager en se transformant en ondes planes dans la région prespore. Le rôle des cellules pretalk serait de diriger le mouvement du ver mais ce seraient les cellules qui exerceraient la force motrice (Dormann et col.1996).

Ces observations un peu contradictoires n’ont pas permis à ce jour de bien comprendre les mécanismes de la propulsion du ver. En particulier, est ce que les cellules prestalk « se sacrifient » pour tirer l’ensemble du ver, ou est ce que ce sont les cellules prespore qui poussent ? Est ce que les ondes planes de cAMP ne font qu’ordonner et diriger le mouvement du ver, ou est ce qu’elles l’accélèrent  également ?

2. Résumé des travaux sur la migration du ver 2D de Dictyostelium

Depuis trois ans,  afin de pouvoir étudier les déformations et les déplacements coordonnés de cellules fluorescentes marquées dans un ver en migration, avec l’équipe de Yasuji Sawada, nous utilisons des vers bidimensionnels (2D). Il s’agit en fait de vers confinés entre une surface d’agar et une lamelle de verre et comportant deux à trois couches de cellules, ils prennent naissance à l’interface eau/huile. Avant l’agrégation et la formation des vers, environ 1% des cellules sont traités avec l’Oregon Green fluorescent par électroporation. Les mouvements de ces cellules sont observés par microscopie de fluorescence. Les images sont prises avec une caméra CCD refroidie à -35°C.

Les principaux résultats présentés dans le manuscrit sont publiés dans Journal of Biological Physics  [PDF] sont les suivants : 

(i) La vitesse des vers 2D est proportionnelle à leur longueur (voir Fig. 2D du manuscrit). Des ondes de mouvements sont présentes dans les vers 2D de plus grande taille (supérieure à 250 mm)  avec une période moyenne de 5 min et une vitesse de propagation de 50 mm/min (voir Fig. 2A-C du manuscrit). Ces valeurs sont indépendantes de la longueur du ver et pratiquement les mêmes que celles mesurées dans les vers 3D. Les résultats obtenus avec le système 2D semblent  donc directement extrapolables au système 3D.

(ii) Les cellules prestalk ont des vitesses (en particulier leur composante perpendiculaire à la direction de migration du ver) et des déformations plus importantes que les cellules prespore qui ont des trajectoires rectilignes dans la direction de migration. L’amplitude des déformations ne semble pas beaucoup augmenter avec la longueur des vers. Par contre, la proportion de cellules polarisées (allongées dans la direction de migration) augmente avec la longueur.

(iii) Lors de leur migration du ver (ou du mouvement d’amibes isolées), on peut  très nettement observer les déformations des billes fluorescentes enrobées dans un élastomère de module d’Young de 5kPa. Dans la zone à l’avant du ver, il n’y a pas de force de traction transmise au support, sinon dans le reste du ver et notamment dans toute la région prespore, la traction est relativement constante (voir Fig. 3 du manuscrit).  

Cette dernière observation semble contredire certaines des expériences mentionnées précédemment (vitesse plus rapide d’une portion prestalk - distribution de la myosine II). Dans l'article Journal of Biological Physics , nous émettons quelques hypothèses pour expliquer cette apparente contradiction. Notre modèle de la migration du ver est finalement essentiellement  le même que celui d’Inouye et Takeuchi (1979). Mais, grâce à nos observations des déformations des supports élastiques (voir ci dessous), nous sommes en mesure d’identifier l’origine de la force de résistance à l’avant du ver : c’est la partie prestalk qui n’exerce aucune force de traction. Le rôle de ces cellules semble être finalement de sentir la meilleure direction de migration du ver en effectuant de multiples mouvements latéraux à l’avant du ver. Mais ce sont essentiellement les cellules prespore qui suivent qui exercent les forces de traction comme le laissaient penser les observations de Dormann et col. (1996).

3. Mesures de forces sur des vers et des cellules de Dictyostelium en migration.

Afin de mieux comprendre les mécanismes de la migration collective, j'ai développé la technique des supports élastiques jusque là utilisée uniquement sur les cellules individuelles, dans le but d’établir une cartographie des forces mécaniques exercées par les cellules du ver en migration. Les déformations sont visualisées avec un microscope confocal grâce à la présence de billes fluorescentes enrobées à l’intérieur du support élastique (Fig. 2A-C, Rieu et col., J. Biol. Phys. 2004). Les calculs des forces à partir des déformations font appel aux lois de l’élasticité et sont assez complexes. Nous les avons réalisés avec Catherine Barentin (LPMCN), en utilisant une méthode itérative (Barentin et col., Eur. Biophys. J., 2005). La distribution des forces est assez remarquable par rapport à toutes celles trouvées jusqu’à présent sur des cellules individuelles. Elle présente clairement des zones de traction au milieu du ver et des zones de friction à l’avant et/ou à l’arrière du ver et d’importantes forces perpendiculaires à la direction du mouvement (Fig. 2D-E, Rieu et col., J. Biol. Phys. 2004).

Nous avons mesuré l’amplitude des forces de traction et de friction en fonction de la vitesse des vers. A notre grande surprise, ces forces sont inversement proportionnelles à la vitesse suggérant une friction cellule/surface de type solide. Nous avons également mieux localisé les forces perpendiculaires qui semblent provenir de la tension exercée par l’enveloppe de glycoprotéines entourant le ver. Ces résultats totalement nouveaux sont publiés dans un long article de 14 pages (Rieu et col., Biophysical Journal 2005)

Récemment, nous avons optimisé les techniques de détection des déformations par corrélation d’image (technique « PIV ») et de calcul des forces avec régularisation des solutions (collaboration avec Hélène Delanoë-Ayari). Le premier objectif est d’améliorer la résolution spatio-temporelle du champ de force des vers, et d’étudier celui de cellules individuelles. Nous avons récemment étudié des vers exprimant ou non un type cellulaire supposé responsable des forces à l’arrière du ver (expérience en cours d’analyse en collaboration avec le Dr. Tamao SAITO, biologiste à l’Université d’Hokkaido).

Fig. 2: (A) Image d’un ver de Dictyostelium en migration sur un support élastique contenant des billes fluorescentes (points) (B) Champ de déformations à un temps donné d’un autre ver. (C) Champ de déformations moyenné dans le repère en translation du ver. (D) Champ de force par unité de surface calculé à partir de (C) montrant les zones de friction (cercle foncé) et de traction (ovales clairs) et (E) Profil le long du ver de la composante parallèle des forces.

3. Références

·        N. Q. Balaban, U. S. Schwarz, D. Riveline, P. Goichberg, G. Tzur, I. Sabanay, D. Mahalu, S. Safran, A. Bershadsky, L. Addadi et B. Geiger: Force and focal adhesion assembly: a close relationship studied using elastic micropatterned substrates. Nature Cell Biol. 3 (2001) 466-472.

·        M. Dembo et Y. -L. Wang:  Stresses at the Cell-to-Substrate Interface during Locomotion of Fibroblasts. Biophys. J. 76 (1999) 2307-2316.

·        D. Dormann, T. Libotte, C. J. Weijer, T. Bretschneider: Simultaneous quantification of cell motility and protein-membrane-association using active contours. Cell Motil Cyto.  52 (2002) 221-30

·        D. Dormann, F. Siegert and C. J. Weijer: Analysis of cell movement during the culmination phase of Dictyostelium development. Development 122 (1996) 761-769.

·        S. Eliott, P.H.Vardy et K.L.Williams: The distribution of myosin II in  Dictyostelium discoideum slug cells. J. Cell Biol. 115 (1991)1267-74.

·        K. Inouye et I. Takeuchi: Analytical studies on migrating movement of the pseudoplsmodium of Dictyostelium discoideum. Protoplasma 99 (1979) 289-304.

·        K.Inouye et I.Takeuchi: Motive force of the migrating pseudoplasmodium of the cellular slime mould Dictyostelium discoideum. J. Cell Sci. 41 (1980) 53-64.

·        F.Siegert et C.J.Weijer: Three-dimensional scroll waves organize Dictyostelium slugs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 6433-6437.